細胞(bao)凍存(cun)液氮(dan)罐是(shi)生(sheng)物(wu)醫(yi)藥(yao)、細(xi)胞(bao)工程、科研(yan)實驗(yan)等(deng)領(ling)域(yu)的(de)核心(xin)設備(bei)，其主要(yao)作用是(shi)通(tong)過-196℃超(chao)低(di)溫(wen)環(huan)境(jing)實現細(xi)胞(bao)的(de)長期(qi)穩定存(cun)儲。在實際應(ying)用中，不少科研(yan)人員(yuan)和(he)實驗(yan)人員(yuan)會(hui)遇到細(xi)胞(bao)復(fu)蘇(su)後存(cun)活(huo)率低(di)的(de)問題，這不僅影(ying)響實驗(yan)進(jin)度，還可(ke)能(neng)造成珍貴(gui)細(xi)胞(bao)樣(yang)本(ben)的(de)損(sun)失(shi)。本(ben)文(wen)將從細(xi)胞(bao)凍存(cun)液氮(dan)罐的(de)使(shi)用(yong)細節出發(fa)，分(fen)析導致細(xi)胞(bao)存(cun)活(huo)率低(di)的(de)常(chang)見原(yuan)因(yin)，並給(gei)出對應的(de)規避措(cuo)施，為相(xiang)關(guan)從(cong)業(ye)者提(ti)供實用(yong)的(de)技術參(can)考(kao)。
壹(yi)、導致細(xi)胞(bao)存(cun)活(huo)率低(di)的(de)常(chang)見使(shi)用(yong)問題
（壹(yi)）液氮(dan)液位不足(zu)，細胞(bao)未完(wan)全(quan)浸(jin)入低(di)溫(wen)環(huan)境(jing)
細胞(bao)凍存(cun)的(de)核心(xin)要(yao)求(qiu)是(shi)樣(yang)本(ben)全(quan)程處於液氮(dan)浸(jin)潤或氣相(xiang)超(chao)低(di)溫(wen)環(huan)境(jing)中，若液氮(dan)罐內(nei)液位過低(di)，細(xi)胞(bao)凍存(cun)管無(wu)法完(wan)全(quan)浸入液氮(dan)，會(hui)導致樣(yang)本(ben)處(chu)於(yu)溫(wen)度波(bo)動(dong)的(de)環境(jing)中，細(xi)胞(bao)內冰(bing)晶(jing)反復(fu)形(xing)成，破壞細胞(bao)膜(mo)和(he)細(xi)胞(bao)器結構(gou)，終導致復(fu)蘇(su)存(cun)活(huo)率下降。部(bu)分(fen)用戶因(yin)未定期監測(ce)液位，或為節省成本刻意(yi)減少液氮(dan)補(bu)充(chong)量(liang)，往(wang)往(wang)會(hui)出(chu)現這(zhe)類問題。
（二）罐內(nei)溫(wen)度不均，局部(bu)區域(yu)出(chu)現溫(wen)度偏差(cha)
優質(zhi)的(de)細胞(bao)凍存(cun)液氮(dan)罐需(xu)保證(zheng)罐內(nei)溫(wen)度均勻(yun)性(xing)，但如果罐內(nei)存(cun)儲架(jia)擺(bai)放(fang)不當(dang)、凍存(cun)管數(shu)量(liang)過多(duo)且(qie)密集，會(hui)影(ying)響罐內(nei)液氮(dan)的(de)循(xun)環，導致局部(bu)區域(yu)溫(wen)度出現偏(pian)差(cha)。此外(wai)，頻繁(fan)開(kai)蓋或開(kai)蓋時間過長，會(hui)讓外界(jie)熱空氣進(jin)入罐內(nei)，破壞罐內(nei)低(di)溫(wen)環(huan)境(jing)的(de)穩定性(xing)，也(ye)會(hui)對細胞(bao)存(cun)儲造成不利影(ying)響。
（三）密封(feng)性(xing)能(neng)下(xia)降，液氮(dan)泄(xie)漏導致環(huan)境波(bo)動(dong)
細(xi)胞(bao)凍存(cun)液氮(dan)罐的(de)密封(feng)性(xing)能(neng)直(zhi)接(jie)影(ying)響(xiang)低(di)溫(wen)環(huan)境(jing)的(de)維(wei)持(chi)，若罐口(kou)密封(feng)墊圈老(lao)化(hua)、損(sun)壞(huai)，或開(kai)蓋後未擰(ning)緊密封(feng)蓋，會(hui)導致液氮(dan)泄(xie)漏，罐內(nei)壓(ya)力和(he)溫(wen)度出現波(bo)動(dong)。同(tong)時，泄漏的(de)液氮(dan)會(hui)使(shi)罐內(nei)濕度增加(jia)，可(ke)能(neng)導致細(xi)胞(bao)凍存(cun)管外壁(bi)結霜(shuang)、密封(feng)蓋受(shou)潮，進(jin)而影(ying)響樣(yang)本(ben)的(de)密封(feng)性(xing)，增(zeng)加(jia)細(xi)胞(bao)汙染(ran)的(de)風(feng)險。
（四(si)）樣(yang)本(ben)存(cun)儲方(fang)式不當(dang)，凍存(cun)管存(cun)在隱患(huan)
樣(yang)本(ben)存(cun)儲環(huan)節的(de)細節失誤也(ye)會(hui)導致細(xi)胞(bao)存(cun)活(huo)率下降。例如，選用(yong)的(de)凍存(cun)管質量(liang)不達標(biao)，低(di)溫(wen)環(huan)境(jing)下出現破裂；凍存(cun)管填充量(liang)不當(dang)，未預(yu)留(liu)液氮(dan)膨(peng)脹空(kong)間導致管體(ti)破裂；樣(yang)本(ben)放(fang)入液氮(dan)罐前(qian)未完(wan)成梯度降溫(wen)，直(zhi)接(jie)投(tou)入低(di)溫(wen)環(huan)境(jing)中，細(xi)胞(bao)內瞬(shun)間形(xing)成大量(liang)冰晶(jing)，破壞細胞(bao)結構(gou)。
二、規避細胞(bao)存(cun)活(huo)率低(di)的(de)實用(yong)措(cuo)施
（壹(yi)）定期監測(ce)液氮(dan)液位，保障充(chong)足(zu)存(cun)儲量(liang)
建議建立(li)液氮(dan)液位定期監測(ce)制(zhi)度，每周(zhou)至(zhi)少監測(ce)1-2次(ci)，可(ke)通過罐身(shen)配(pei)備(bei)的(de)液位計或專用液位監測(ce)工具進(jin)行查看。當(dang)液位低(di)於(yu)罐身(shen)標(biao)註(zhu)的(de)低(di)刻(ke)度線（通常(chang)為(wei)罐容(rong)的(de)1/3）時，需(xu)及(ji)時補(bu)充(chong)液氮(dan)，確(que)保所(suo)有(you)細(xi)胞(bao)凍存(cun)管完全浸入液氮(dan)中。對於長期(qi)無(wu)人值守(shou)的(de)存(cun)儲場景，可選用(yong)帶有(you)液位報(bao)警功(gong)能(neng)的(de)細胞(bao)凍存(cun)液氮(dan)罐，當(dang)液位過低(di)時(shi)自(zi)動(dong)觸發(fa)報(bao)警，提(ti)醒(xing)工作人員(yuan)及(ji)時補(bu)充(chong)。
（二(er)）規範存(cun)儲擺(bai)放(fang)，減少罐內(nei)溫(wen)度波(bo)動(dong)
存(cun)儲細(xi)胞(bao)凍存(cun)管時，需合(he)理擺(bai)放(fang)存(cun)儲架(jia)，避免密集堆(dui)疊(die)，預(yu)留(liu)足(zu)夠(gou)的(de)液氮(dan)循(xun)環空(kong)間。每次(ci)開(kai)蓋取(qu)放(fang)樣(yang)本(ben)時(shi)，動(dong)作要(yao)迅速(su)，開(kai)蓋時間控(kong)制(zhi)在10秒以(yi)內(nei)，減(jian)少熱空(kong)氣進(jin)入。同(tong)時(shi)，盡(jin)量(liang)集中取(qu)放(fang)樣(yang)本(ben)，避(bi)免頻(pin)繁(fan)開(kai)蓋。若需(xu)長期(qi)頻繁(fan)取(qu)放(fang)樣(yang)本(ben)，可(ke)選用(yong)雙(shuang)蓋設(she)計(ji)的(de)液氮(dan)罐，內(nei)層蓋(gai)減(jian)少液氮(dan)蒸發(fa)，外(wai)層(ceng)蓋(gai)保(bao)障密封(feng)，進(jin)壹(yi)步(bu)維(wei)持(chi)罐內(nei)溫(wen)度穩定。
（三）定期檢(jian)查密封(feng)性(xing)能(neng)，及(ji)時維(wei)護(hu)設(she)備(bei)
每月(yue)定期檢(jian)查罐口(kou)密封(feng)墊圈的(de)狀(zhuang)態，若發(fa)現墊圈老(lao)化(hua)、變(bian)形(xing)或破損(sun)，需(xu)及(ji)時更(geng)換同型(xing)號(hao)的(de)耐低(di)溫(wen)密封(feng)墊圈。每次(ci)補(bu)充(chong)液氮(dan)或取(qu)放(fang)樣(yang)本(ben)後，確(que)保密封(feng)蓋擰(ning)緊到位，避免出(chu)現松動(dong)。此(ci)外，定期檢(jian)查液氮(dan)罐的(de)真(zhen)空度，若發(fa)現液氮(dan)蒸發(fa)速(su)度明顯(xian)加(jia)快(kuai)，可(ke)能(neng)是(shi)真(zhen)空層(ceng)失效(xiao)，需聯系(xi)廠(chang)家(jia)進(jin)行維(wei)修(xiu)或保養。
（四）規範樣(yang)本(ben)處(chu)理，降低(di)存(cun)儲風(feng)險
選用(yong)符合(he)標(biao)準的(de)低(di)溫(wen)-resistant凍(dong)存(cun)管，使(shi)用(yong)前檢(jian)查管體(ti)是(shi)否(fou)有破損(sun)、裂(lie)紋(wen)。凍存(cun)管內樣(yang)本(ben)填充量(liang)控(kong)制(zhi)在70%-80%，預留(liu)足(zu)夠(gou)的(de)液氮(dan)膨(peng)脹空(kong)間，避免低(di)溫(wen)下(xia)管體(ti)破裂。樣(yang)本(ben)放(fang)入液氮(dan)罐前(qian)，需按(an)照規範完成梯度降溫(wen)（如先(xian)置(zhi)於-80℃冰(bing)箱預冷2-4小時，再轉(zhuan)入液氮(dan)罐），減(jian)少細胞(bao)內冰(bing)晶(jing)的(de)形(xing)成。同時，做好樣(yang)本(ben)標(biao)記，避免取(qu)放(fang)時混淆或誤操(cao)作。
三、總(zong)結
細(xi)胞(bao)凍存(cun)液氮(dan)罐使(shi)用(yong)中細(xi)胞(bao)存(cun)活(huo)率低(di)的(de)問題，多(duo)與(yu)液位監測(ce)不及(ji)時、溫(wen)度控(kong)制(zhi)不當(dang)、密封(feng)維(wei)護(hu)不到位及(ji)樣(yang)本(ben)處(chu)理不規範相(xiang)關(guan)。通(tong)過建立定期監測(ce)機(ji)制(zhi)、規範存(cun)儲擺(bai)放(fang)、做好設(she)備(bei)維(wei)護(hu)和(he)樣(yang)本(ben)處(chu)理等(deng)措(cuo)施，可有效規避這些(xie)問題，保障細(xi)胞(bao)存(cun)儲的(de)穩定性(xing)和(he)復(fu)蘇(su)存(cun)活(huo)率。在選擇細胞(bao)凍存(cun)液氮(dan)罐時(shi)，建議優先(xian)選用(yong)密封(feng)性(xing)能(neng)好、溫(wen)度均勻(yun)性(xing)優且(qie)具(ju)備(bei)必要(yao)安全(quan)監測(ce)功(gong)能(neng)的(de)設備(bei)，從源(yuan)頭(tou)降低(di)使(shi)用(yong)風(feng)險。若在使(shi)用(yong)過程中遇到復(fu)雜(za)問(wen)題，可及(ji)時聯(lian)系(xi)設(she)備廠(chang)家(jia)獲(huo)取(qu)專業(ye)的(de)技術支持(chi)。
